RNA甲基化修饰m7G（7- 甲基鸟嘌呤），是 tRNA 上最丰富的修饰类型之一，与 tRNA 稳定性和肿瘤等人类疾病密切相关。TRAC-seq（m7G tRNA Reduction andCleavage-Sequence），即 m7G tRNA 还原和断裂测序，系基于AlkB去甲基化酶的tRNA m7G修饰研究方法，无需抗体，高效完成单核苷酸分辨率的 tRNA m7G修饰图谱绘制。
技术应用
1. tRNA转录组全局m7G修饰定位
2. 研究METTL1-WDR4甲基化转移酶介导的tRNA稳定性等生理机制
3. 研究肿瘤等疾病的tRNA m7G修饰异常表达，探究疾病发生发展机制
技术优势
1. 结合小RNA分离步骤，选取tRNA进行处理，针对性强
2. 去甲基化酶AlkB处理，极大提高tRNA反转录效率，获得完整tRNA修饰图谱
3. 利用AlkB和NaBH4还原步骤，无需抗体，结果无偏移、高效
4. 精确识别tRNA修饰，达到单核苷分辨率
技术原理
提取小 RNA，细菌去甲基化酶 AlkB 处理，去除大部分 tRNA 修饰，然后 NaBH4 和苯胺处理，诱导 m7G修饰位点的 RNA 骨架的还原和断裂。具有规则的 3’端的切割产物加上接头，建库测序
送样要求
样本类型：
1. 细胞，≥ 2×107个细胞/ 样本
2. 组织，≥ 50mg/ 样本
3. 总RNA，≥ 100μg/ 样本，RIN 值≥ 6
样本物种：仅限人、大小鼠，其他物种需评估
分析内容
1. 测序原始reads去接头，质量控制（QC）
2. 参考基因组比对（Mapping）
3. 化学剪切鉴定
4. tRNA m7G鉴定
4.1 表达定量
4.2 差异分析
4.3 motif分析
4.4 关联分析
表观生物实测数据
图 1. m7G修饰位点鉴定分析
图 2.Motif 分析
图 3.差异m7G修饰水平火山图
案例分析
Mol Cell：m7G tRNA修饰增强致癌mRNA翻译，促进肝内胆管癌发展[1]
该研究首先通过对TCGA数据库中22种 tRNA修饰酶表达分析发现，tRNA m7G修饰相关的METTL1在肝内胆管癌（ICC）中表达显著上调；通过 TRAC-seq，发现 METTL1敲除后，ICC中的 m7G修饰丰度减少，其修饰的 tRNA 表达水平也明显下降（RNA-seq）；进一步利用 Ribo-seq 发现敲除 METTL1 后，影响基因翻译，表明 METTL1介导的 tRNAm7G 修饰具有调控 tRNA 水平和细胞翻译的功能。后续深入的机制研究表明，ICC 细胞可以通过 m7G tRNA 解码的密码子频率偏倚机制，选择性调控了包括 EGFR 信号、细胞周期在内的多种相关癌基因的翻译，进而进 ICC 的进展。
图 4.对 HuCCT1 细胞进行 TRAC-seq;结果显示 m7G 位点的“RGGUY”motif
图 5.TRAC-seg 检测 22 种m7G 修饰的 tRNA 的表达: METTL敲降后,大部分被m7G修饰的 tRNA 表达水平下降,而对无m7G 修饰的 RNA 影响不明显
参考文献
[1] Dai Z, Liu H, Liao J, et al. N7-Methylguanosine tRNA modifification enhances oncogenic mRNA translation and promotes intrahepaticcholangiocarcinoma progression. Mol Cell. 2021 Aug 19;81(16):3339-3355.e8.