原代细胞的分离、培养和鉴定protocol)
小鼠新生表皮角质形成细胞(NEK)原代细胞的分离
- 简介：
皮肤是人体面积最大的器官，由表皮和真皮构成，以皮下组织与深层组织相连。表皮是皮肤的浅层，分为厚皮和薄皮。厚皮自下而上分为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。
新生角质形成细胞（ Neonatal epidermal keratinocytes，NEK）来自新生小鼠的表皮，是其的主要构成细胞，占表皮细胞的90%以上。表皮由基底层到角质层的结构变化反映了角质形成细胞增殖、迁移、分化等新陈代谢过程。
成纤维细胞是真皮组织的主要组成成分，位于皮肤的真皮网织层，可分泌细胞外基质构成细胞骨架及多种细胞因子，参与瘢痕形成、皮肤损伤的修复和再生，对抗皮肤衰老。
中性蛋白酶-胰蛋白酶混合消化法
二、材料：
1、实验动物: 出生1-3天的Balb/c 乳鼠（雌雄不限）
2、组织来源：背部皮肤
3、手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）、手术刀
4、消化酶：中性蛋白酶（麦克林，Cat#: D915910）、0.25%胰酶（翊圣，Cat#: 40101ES25）
5、培养基：K-SFM 培养基（Gibco，Cat#:17005042）
三、实验步骤
1、取材
①取5-6只出生72小时内的balb/c乳鼠，断颈处死后置于75%酒精中消毒2次，每次1-2分钟。
②移入超净工作台内，用含有2%双抗的PBS浸泡洗去除大鼠皮肤表面残余酒精，取乳鼠背部皮肤。
③用手术剪和手术镊仔细的去除皮下组织（主要是脂肪和肌肉、血管等组织，尽可能的去除干净），用含2%双抗的PBS清洗2次。 将其修剪成约5mm×10mm正方形小块，
- 真皮和表皮的分离
①将取得的皮肤样品平铺置于另一个干净的培养皿中，表皮面朝上，加入10ml的2.5mg/ml（0.25%）的中性蛋白酶（Dispase）(用不含血清的DMEM 稀释)，使表皮向上浸没入酶液中，4℃过夜（12-16小时左右）。
②用手术镊将表皮轻轻从真皮上撕下（表皮向上，用手术镊压住组织边缘，另一手术镊夹住表皮将其从真皮上撕下），将分离的表皮置于新的培养皿中。
- 组织消化
①将分离后的表皮用手术刀充分切碎，加入2ml 的0.25%胰酶，于37℃条件下孵育20~25min，消化过程中每5分钟用移液枪轻轻吹打促进细胞脱落。
②待大量细胞脱落（溶液变浑浊），加入适量的FBS终止消化，经200目筛网过滤后，滤液以1000rpm离心5min，去掉上清，细胞沉淀用K-SFM培养基进行重悬，接种于6孔板或者T25培养瓶中，置于培养箱中进行培养。
③角质形成细胞培养24~48h后首次换液(期间镜下观察到细胞大量贴壁），待细胞长至80-90%后，可进行传代。
图.云克隆分离的小鼠皮肤表皮组织
图.云克隆分离的小鼠皮肤真皮组织
- 各阶段的角质形成细胞照片
图.云克隆小鼠角质形成细胞形态
五、小鼠新生表皮角质形成细胞的鉴定
常用鉴定方法：CK-18和ZO-1免疫荧光染色
图.云克隆小鼠角质形成细胞荧光鉴定（CK-18）
图.云克隆小鼠角质形成细胞荧光鉴定（CK-19）
武汉云克隆有近二十年的原代细胞研发经验，依托GMP级细胞制备平台与专业技术团队不仅构建了丰富来自大、小鼠，兔，犬，猫，山羊，豚鼠等560多种动物源原代细胞产品体系。更打造了从实验设计、细胞选型、培养操作到数据解读的全链条技术支持服务。